Связь между объемом опухоли до операции, вычисленным по результатам магнитно-резонансной томографии, и временем выживания после операции у собак с первичной внутричерепной глиомой

Ретроспективное когортное исследование

Авторы: Jeffrey D. MacLellan DVM; Susan A. Arnold DVM; Aditya C. Dave DVM; Matthew A. Hunt MD; G. Elizabeth Pluhar DVM, PHD.

Кафедра ветеринарных клинических наук, ветеринарный колледж, Университет Миннесоты, Сент-Пол, MN 55108. Текущий адрес Dr. MacLellan: Sierra Veterinary Specialists, 932 Ryland St, Reno, NV 89502. Текущий адрес Dr. Arnold: Department of Small Animal Medicine and Surgery, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA 30605.

Цель: оценить зависимость между предоперационным объемом первичной внутричерепной глиомы у собак по данным МРТ и временем выживания после хирургического уменьшения объема опухоли и дополнительной иммунотерапии.
Животные: 47 принадлежащих владельцам собак, зачисленных в клинические исследования, посвященные лечению глиомы.
Процедуры: ретроспективно рассматривали истории болезни всех собак с гистологически подтвержденной глиомой, перенесших краниотомию в ветеринарном центре при Университете Миннесоты с 2008 по 2015 гг., и собирали данные об исходе. Объем опухоли в процентах от общего объема свода черепа измеряли по предоперационным Т2- или Т1-взвешенным снимкам после введения гадолиния, сделанным в нескольких специализированных центрах на томографах с магнитным полем от 0,5 до 3,0 Т. Данные анализировали для оценки влияния каждых дополнительных 2 % объема опухоли на медиану времени выживания (МВВ) после операции и дополнительной терапии.
Результаты: объем опухоли варьировался от 0,5 до 12,2 % от общего объема черепа. В целом МВВ составила 185 дней (диапазон от 2 до 802 дней). Зависимости между предоперационным объемом опухоли и МВВ выявлено не было. Опухоли низкой степени злокачественности и относительно малого объема обнаружены всего у 3 (6 %) собак, они составляли 1,4, 2,1 и 4,3 % от общего объема свода черепа. МВВ у этих трех собак (727 дней) была больше, чем у животных с опухолями высокой степени злокачественности (174 дня), однако в связи с малым количеством собак, имеющих опухоли низкой степени злокачественности, статистического сравнения не проводили.
Выводы и клиническая значимость: исход операции и дополнительного лечения у собак с глиомой не зависел от предоперационного объема опухоли, вычисленного с помощью МРТ, и объем опухоли не мог служить прогностическим показателем. Степень злокачественности опухоли позволяла прогнозировать исход, однако в отличие от измерения объема по МРТ-снимкам для окончательного диагноза стадии опухоли требовалась инвазивная биопсия (J Am Vet Med Assoc 2018; 252: 98–102).

С ростом доступности современных методов визуальной диагностики, таких как МРТ, диагноз первичных опухолей головного мозга у животных стал более заурядным явлением1. Первичные опухоли головного мозга могут развиваться из клеток разных типов. Среди первичных внутричерепных опухолей у собак распространенность новообразований из глиальных клеток достигает 1,0 % (на основании опубликованных обзоров и результатов вскрытия)2.
К глиомам относится несколько типов первичных опухолей, таких как астроцитома, олигодендроглиома, эпендимома и глиобластома. Эти опухоли также классифицируются по степени злокачественности на основании гистологической оценки и биологических особенностей. В недавнем исследовании3 удалось добиться высокой точности и согласия результатов у разных наблюдателей при измерении объема опухоли по МРТ-снимкам планиметрическим методом. Эти результаты дают основания полагать, что после непродолжительного обучения клиницисты смогут правильно выполнять такие измерения с помощью специального общедоступного программного обеспечения4. В данном исследовании также отмечено согласие результатов при измерении объема опухоли по МРТ-снимкам, сделанным в разных проекциях (коронарной, сагиттальной и осевой).
Проводились исследования стандартных способов лечения всех типов первичных опухолей головного мозга у собак5–10. Систематический обзор этих способов показал, что лучевая терапия или хирургическое лечение дают лучший результат в сравнении с симптоматическим лечением11. Хотя в этот обзор вошли опухоли, расположенные вне вещества мозга (предположительно, менингиомы), внутри вещества мозга (предположительно, глиомы) и опухоли гипофиза11, результаты дают основания полагать, что тщательная хирургическая резекция менингиом ведет к увеличению МВВ. Ограниченная доступность квалифицированных хирургов, а также отсутствие достоверных данных об исходе могут повлиять на решение о лечении собаки с первичной опухолью головного мозга, особенно располагающейся внутри его вещества.
По мере роста числа практикующих ветеринарных врачей, использующих современные методы визуальной диагностики для исследования головного мозга, появляются данные о визуальных особенностях различных опухолей, помогающие принять обоснованное клиническое решение. В большинстве ситуаций с внутричерепными опухолями их тип и степень злокачественности неизвестны до операции. Таким образом, клиницистам приходится принимать решения и давать объяснения владельцам, обладая ограниченной информацией, в том числе полученной с помощью МРТ. Доказано, что размер опухоли влияет на прогноз и МВВ при некоторых типах опухолей, таких как рак щитовидной железы и опухоли молочных желез12 13. Однако при опухолях селезенки у собак увеличение размера новообразования относительно массы тела улучшает прогноз, и более крупные опухоли с большей вероятностью являются доброкачественными, чем более мелкие14.
Описанное здесь исследование проведено с целью установить, связан ли размер первичной внутричерепной глиомы с МВВ у собак, перенесших хирургическое уменьшение размера опухоли с лечебной целью и иммунотерапию на основе аутологичной вакцины. Наша гипотеза заключалась в том, что общее время выживания должно быть обратно пропорционально объему первичной опухоли до операции.

Материалы и методы

Животные
Рассматривали все истории болезни собак с гистологически подтвержденными глиальными опухолями, перенесших краниотомию в ветеринарном центре при Университете Миннесоты с 2008 по 2015 гг. Все эти животные участвовали в клинических исследованиях иммунотерапевтического лечения первичной глиомы высокой степени злокачественности. Для включения в исследования собаки должны были иметь выявленное при МРТ одиночное внутричерепное новообразование с характерными особенностями глиомы, операбельное по мнению двух исследователей (GEP и MAH), а также способность пережить наркоз, необходимый для хирургической резекции и послеоперационной МРТ. Определение пригодности животного для операции осуществлялось хирургом с учетом того, что многие собаки имели неоперабельные (с точки зрения неврологов, направивших этих пациентов на лечение) опухоли, однако из исследования исключали только собак с опухолями структур ствола мозга. Другими критериями исключения были тяжелые неврологические нарушения, такие как выраженная грыжа, состояние ступора или более низкого уровня сознания, другие опухоли мозга, кроме глиомы высокой степени злокачественности, опухоли структур ствола мозга и тяжелое сопутствующее заболевание (иные злокачественные новообразования) или системное заболевание (например, гиперадренокортицизм). В частности, из настоящего исследования исключали собак, у которых предоперационные МРТ-снимки не относились к типу, подходящему для измерения объема опухоли (Т2- или Т1-взвешенные изображения после введения гадолиния).

Обзор историй болезни
Из историй болезни извлекали следующие данные: возраст, пол, породу, дату МРТ, дату операции, дату смерти, гистологический тип и степень злокачественности опухоли. В рамках исследований со сторонним финансированием, в которых участвовали животные, за каждой собакой наблюдали, связываясь с владельцем и/или направившим пациента на лечение ветеринарным врачом после каждого назначенного сеанса иммунотерапии и при контрольных МРТ. За всеми собаками наблюдение осуществлялось в течение 1 года после операции или до самой смерти, которая в редких случаях наступала более чем через 1 год после операции. После смерти собак у владельцев просили разрешения на исследование головного мозга животного для оценки роста опухоли, чтобы установить, была ли смерть связана с заболеванием.

Измерение объема опухоли
Объем опухоли измеряли по имеющимся МРТ-снимкам. Это современное визуальное исследование проводилось в нескольких специализированных учреждениях с помощью томографов с магнитным полем от 0,5 до 3,0 Т. Использовали Т2- или Т1-взвешенные изображения после введения гадолиния. Основной автор (JDM) анализировал изображения в осевой и сагиттальной проекциях (изображения в дорсальной или коронарной проекции имелись не у всех собак). Второй наблюдатель (ACD) рассматривал снимки в осевой проекции. Собак исключали из дальнейшего анализа в случае отсутствия изображений достаточного разрешения при последовательности любого типа в осевой и сагиттальной проекциях.
Объем опухоли как пропорцию от общего объема свода черепа определял основной автор по снимкам в осевой и сагиттальной проекциях согласно описанной ранее технике планиметрии3. Каждую опухоль оценивали срез за срезом как в осевой, так и в сагиттальной проекции. Для вычисления объема опухоли сумму измеренных площадей умножали на сумму толщины среза и межсрезового интервала в каждой проекции. Эти же изображения, срез за срезом, оценивали для измерения общего объема в пределах свода черепа, включая паренхиму мозга, опухоль, СМЖ и мозговые оболочки. Объем опухоли вычисляли как процент от общего объема свода черепа, чтобы учесть различия в размерах собак.

Статистический анализ
Для анализа использовали данные о лечении, дополняющем хирургическое уменьшение объема, а также данные о выживании. Анализ проводили с помощью статистической программы. Степень единообразия между наблюдателями оценивали, вычисляя индекс согласия по следующему уравнению8:
Индекс согласия = 1 – (xa – xb)/([xa + xb]/2)
где xa – среднее от измерений первого оператора и xb – среднее от измерений второго оператора. Если индекс согласия приближается к единице, два сравниваемых результата измерения объема считаются менее вариабельными и, следовательно, более достоверными. Вычисляли выживаемость через 6 месяцев, 1 год и > 2 лет (от завершения операции и дополнительной иммунотерапии) в зависимости от каждых дополнительных 2 % объема опухоли. Критерий χ2 и γ-критерий Гудмана – Крускала использовали для оценки влияния на выживаемость пациентов увеличения объема опухоли на каждые 2 %. Подбирали несколько регрессионных моделей пропорциональных рисков Кокса со статусом выживания собаки после операции в качестве зависимой переменной. Гипотезу о пропорциональности в моделях пропорциональных рисков Кокса проверяли путем визуальной оценки кривых выживания. Сначала была предложена простая модель, включающая только данные снимков в осевой проекции и деление этих значений на 2 категории: маленький и большой объем опухоли. В последующем ее усложнили путем стратификации по независимой переменной дополнительного лечения и проверки других вариантов для переменной объема опухоли. Для каждой модели вычисляли ОШ (отношение шансов) и 95 % доверительные интервалы. Значения Р < 0,05 считали значимыми.

Результаты

Для оценки выбрано 60 собак, перенесших краниотомию и дополнительное лечение в связи с первичными опухолями из глиальных клеток за исследуемый период. Из этих собак 13 (22 %) были исключены из анализа из-за недоступности некоторых необходимых послеоперационных МРТ-последовательностей, таким образом, в исследовании осталось 47 собак. Окончательный гистологический диагноз во всех случаях был поставлен несколькими сертифицированными ветеринарными гистологами при консультации медицинского невропатолога. Типы и степени злокачественности опухолей были следующими: астроцитома 2-й степени (n = 3), анапластическая астроцитома 3-й степени (11), анапластическая олигодендроглиома 3-й степени (17), полиморфная глиобластома 4-й степени (15) и примитивная нейроэктодермальная опухоль 4-й степени (1). Таким образом, 3 (6 %) опухоли были отнесены к низкой степени злокачественности, а 44 (94 %) – к высокой.
Все собаки, включенные в исследование, перенесли хирургическое уменьшение размера опухоли, располагавшейся в веществе мозга, с лечебной целью, и получали дополнительную терапию на основе вакцины, приготовленной из лизата аутологичной опухоли. Все собаки, кроме трех (т. е. 94 %), умерли или подверглись эвтаназии по требованию владельца ко времени статистического анализа. Посмертное исследование головного мозга проведено во всех случаях, кроме четырех. У 29 собак обнаружены признаки рецидива болезни, а у трех собак – патологические изменения в паренхиме мозга, которые приписали иммунотерапии. Одна собака подверглась эвтаназии после эпизода эпилептического статуса, который отвечал на лечение, однако при вскрытии у пациента не было обнаружено изменений мозга. Другие собаки без рецидива опухоли подверглись эвтаназии по иным причинам, таким как некротизирующий панкреатит и другие новообразования.
Общая МВВ 47 собак в исследовании составила 185 дней (диапазон 2–802 дня). Значительных различий в выживаемости или МВВ у собак с опухолями высокой степени злокачественности разных типов не обнаружено. Однако три собаки с опухолями низкой степени злокачественности прожили в численном выражении больше, чем собаки с опухолями высокой степени злокачественности, в частности не менее 532, 727 и 802 дней после операции. В связи с малым числом собак, имевших опухоли низкой степени злокачественности, статистического сравнения с собаками, имевшими опухоли высокой степени злокачественности, не проводили.

Согласие между наблюдателями было сравнимым с описанным в предыдущем исследовании по измерению опухолей головного мозга у собак3. Средний ± СО (стандартное отклонение) индекс согласия составил 0,90 ± 0,07. Средний ± СО объем опухоли как пропорция от общего объема свода черепа составил 4,70 ± 3,07 (диапазон 0,80–12,20 %) для снимков в осевой проекции и 4,56 ± 304 % (диапазон 0,50–11,70 %) для снимков в сагиттальной проекции.

Если данные стратифицировали по относительному объему опухоли с шагом увеличения 2 %, связь между размером опухоли и выживаемостью через 6 месяцев, 1 или 2 года отсутствовала (критерий χ2, Р = 0,78; γ-критерий Гудмана – Крускала, Р = 0,28; табл. 1). Для повышения статистической мощности за счет увеличения числа собак (и, следовательно, опухолей) в каждой группе сравнения анализ повторили после повторной классификации опухолей с разделением на две более широкие по количеству пациентов группы на основании естественного разделения собак по объему опухоли в процентах от общего объема свода черепа. Это были группы маленького (объем опухоли < 4 % от общего объема свода черепа; n = 24) и большого объема (объем опухоли > 4 % от общего объема свода черепа; n = 23). Несмотря на увеличение количества собак на группу, значительных различий между кривыми выживания собак с маленьким и большим объемом опухоли выявлено не было (рис. 1). 

Таблица 1. Число (%) собак, проживших 6 месяцев, 1 и 2 года после хирургического уменьшения объема опухоли и последующей дополнительной иммунотерапии для лечения первичной внутричерепной глиомы в зависимости от относительного объема опухоли.

Относительный объем опухоли (%)	6 месяцев	1 год	2 года
0–2,0 (n = 8)	4 (50)	1 (12)	0
2,1–4,0 (n = 17)	7 (41)	4 (24)	2 (12)
4,1–6,0 (n = 9)	3 (33)	2 (22)	0
6,1–8,0 (n = 5)	2 (40)	1 (20)	0
8,1–10,0 (n = 4)	3 (75)	2 (50)	0
> 10 (n = 4)	3 (75)	2 (50)	1 (25)
Total (n = 47)	22 (47)	12 (25)	3 (6)

Рис. 1. Кривые выживания Каплана – Мейера 47 собак с глиомой, сгруппированных в зависимости от размера опухоли: ≥ 4 % (жирная линия) или < 4 % от общего объема свода черепа. Время выживания вычисляли с момента завершения операции по уменьшению объема опухоли. Вертикальные метки на кривых показывают собак, которые были все еще живы (n = 3) ко времени анализа.

Обсуждение

Результаты настоящего исследования дают основания полагать, что размер опухоли, измеренный как пропорция от общего объема свода черепа, не имеет значимой связи с временем выживания собак с первичный внутричерепной глиомой после хирургического уменьшения объема опухоли и дополнительной иммунотерапии. Для исследования взяты данные собак, направленных в Университет Миннесоты для участия в клинических исследованиях с использованием хирургического лечения и (в большинстве случаев) дополнительной иммунотерапии. С целью исключения систематической ошибки отбора директор программы клинических исследований лично просматривал все МРТ-снимки, и владельцам животных предлагали принять участие в исследовании в том случае, если опухоль располагалась в веществе мозга и признавалась операбельной. Собак с опухолями в стволе мозга не зачисляли в исследование из-за крайне высокой смертности после хирургической резекции менингиомы ствола мозга. Ни одной из направленных собак ранее не делали биопсию внутричерепного очага, таким образом, проводили отбор пациентов с предположительным диагнозом «глиома».
У всех собак внезапно развивались симптомы нарушения ЦНС, прежде всего генерализованные судороги или изменения поведения, что послужило поводом для МРТ-исследований, показавших одиночные внутричерепные новообразования с особенностями, характерными для глиомы. Многим из этих собак требовалось интенсивное поддерживающее лечение до или после МРТ, и было очевидно, что собак, состояние которых не удавалось стабилизировать, не стоит направлять для зачисления в исследование. Животные получали соответствующее паллиативное лечение противоэпилептическими препаратами для контроля судорог и кортикостероиды для уменьшения отека мозга, чтобы стабилизировать состояние пациентов перед направлением. Собак, состояние которых не удавалось стабилизировать после МРТ, не направляли для участия в клинических исследованиях. Таким образом, в соответствии с критериями включения в данные исследования и исключения из них большинство собак в целом чувствовали себя хорошо и их ментальное состояние не было нарушено на момент операции, однако присутствовали остаточные неврологические нарушения, такие как движение по кругу, потеря осознанной проприоцепции и слепота. Тем не менее было включено небольшое число собак с декомпенсацией, неврологическое состояние которых было нестабильным непосредственно перед операцией и которые перенесли вмешательство, расценивающееся как экстренная декомпрессионная краниотомия для спасения жизни. Остается неясным, что привело к декомпенсации у этих собак: размер опухоли, некоторые другие факторы (например, степень связанного отека мозга или грыжа) или сочетание этих факторов.
Ни одну из опухолей не получилось удалить единым блоком из-за желеобразной консистенции большинства глиом высокой степени злокачественности, что ограничивало возможности определения истинного размера опухоли.  Таким образом, еще одним ограничением настоящего исследования стало отсутствие данных, подтверждающих точность измерений объема опухоли по результатам МРТ. Несмотря на то что единственный способ точно измерить объем опухоли заключается в извлечении всей предположительно опухолевой ткани мозга, отделении гистологически подтвержденной опухолевой ткани от нормальной и измерении объема фактической опухолевой ткани, данный метод нереалистичен в клинической практике для пациентов с опухолями мозга. Сложно даже собрать всю иссеченную опухолевую ткань, учитывая консистенцию большинства глиом и способы их удаления. 
У собак в настоящем исследовании обнаружено несколько типов глиом. Насколько известно авторам статьи, данных о различиях во времени выживания у собак с глиомами разных типов и степеней злокачественности нет. Собак зачисляли в клинические исследования с предположительным диагнозом опухоли из глиальных клеток на основании картины опухоли при МРТ. Гистологическая оценка показала, что всего 3 опухоли имели низкую степень злокачественности. Чтобы установить, существует ли какая-то систематическая ошибка, при которой маленькие или крупные опухоли с большей вероятностью попадают в конкретную гистологическую категорию, мы оценили размер 3 опухолей низкой степени злокачественности. Одна из этих опухолей попадала в категорию 0–2 % от объема свода черепа, а две другие – в категорию 2–5 %, таким образом, опухоли низкой степени злокачественности относились к группе маленьких (общий объем опухоли < 4 %). Из-за небольшого числа собак в нескольких категориях процентного объема статистическая мощность оказалась недостаточной для выявления зависимостей между размером опухоли и временем выживания или выживаемостью.

Результаты описанного здесь исследования дают основания полагать, что предоперационный размер опухоли у собак с внутричерепными глиальными опухолями не влияет на прогноз после хирургического уменьшения объема опухоли и дополнительной иммунотерапии. Зачисление в клинические исследования животных не зависело от размера имеющейся у них опухоли. Удивительно, что самая крупная опухоль в этом исследовании занимала 12 % от общего объема свода черепа, хотя многие опухоли по субъективной оценке занимают от 30 до 40 % объема мозга. Вероятно, эта крупная опухоль соответствовала 30–40 % объема мозга, который составляет лишь часть общего объема свода черепа. Учитывая, что некоторые опухоли располагались не в больших полушариях, а в других областях мозга, мы предположили, что выражение объема опухоли в процентах от общего объема свода черепа будет более подходящим.
В связи с использованием МРТ-последовательностей, сделанных в специализированных клиниках, для предоперационного анализа мы измеряли объем опухоли по Т2-взвешенным изображениям, если в опухоли отсутствовало усиление контраста при исследовании с гадолинием. Возможно, фактический объем опухоли в такой ситуации был слегка переоценен при наличии отека, связанного с опухолью. Снимки в режиме инверсии-восстановления с ослаблением сигнала от жидкости, позволяющие четко дифференцировать опухолевую ткань и отек, подошли бы для анализа лучше, однако такие снимки имелись не у всех собак. Вероятно, что различиям в МВВ в этих ситуациях способствовали другие факторы, такие как степень злокачественности опухоли (учитывая наблюдаемое различие между опухолями низкой и высокой степени злокачественности) и полнота иссечения. Однако эта информация не была доступна клиницистам при принятии решения о лечении. Всем собакам, включенным в настоящее исследование, повторяли МРТ сразу после операции и периодически в последующем до самой смерти в рамках стандартного ветеринарного обслуживания.
Также вероятно, что на длительность бессимптомного интервала и МВВ влияли и другие факторы, специфические для каждой опухоли. Возможно, метаболизм опухоли и нарушение внутричерепного кровообращения влияли на время выживания, поэтому использование позитронно-эмиссионной томографии для построения карты опухолевой активности и мозгового кровообращения, а также количества остаточной опухолевой ткани после удаления могло бы помочь лучше понять факторы, связанные с временем выживания. 
Хотя связь была незначимой, данные настоящего исследования дают основания предполагать немного более высокие шансы на выживание в течение 6 месяцев у собак с первичной внутричерепной глиомой большего размера по сравнению с опухолями меньшего размера. 
Отсутствие значимости могло объясняться ошибкой второго рода из-за малого числа собак, что представляет собой еще одно ограничение исследования. Кроме того, не предпринималось попыток дифференцировать МВВ в зависимости от незначительных различий в протоколах дополнительной иммунотерапии. Однако предварительный анализ данных клинических исследований, проведенный нашей научной группой, не показал различий во времени выживания у собак с глиомой высокой степени злокачественности при разных протоколах лечения. Направление в специализированное учреждение для визуальной диагностики современными методами с последующей краниотомией в настоящее время редко встречается в ветеринарии, однако хирургическая техника и дополнительные методы лечения быстро развиваются. Результаты описанного здесь исследования могут помочь практикующим ветеринарным врачам при интерпретации данных МРТ у собак с внутричерепными глиальными опухолями, а также содержат основные сведения о влиянии размера опухоли на выживание после хирургического лечения.

Литература:

1. Moore M. P., Bagley R. S., Harrington M. R., et al. Intracranial tumors. Vet Clin North Am Small Anim Pract; 26:759–777, 1996. 
2. Song R. B., Vite C. H., Bradley C. W., et al. Postmortem evaluation of 435 cases of intracranial neoplasia in dogs and relationship of neoplasm with breed, age, and body weight. J Vet Intern Med; 27:1143–1152, 2013. 
3. Thomson C. B., Haynes K. H., Pluhar G. E. Comparison of visual metric and planimetry methods for brain tumor measurement in dogs. Am J Vet Res; 77:471–477, 2016. 
4. Rosset A., Spadola L., Ratib O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging; 18:270–279, 2004. 
5. Oliver J. E. Surgical approaches to the canine brain. Am J Vet Res; 29:353–378, 1968. 
6. Turrel J. M., Fike J. R., LeCouteur R. A., et al. Radiotherapy of brain tumors in dogs. J Am Vet Med Assoc; 184:82–86, 1984. 
7. Kostolich M., Dulisch M. L. A surgical approach to the canine olfactory bulb for meningioma removal. Vet Surg; 16:273–277, 1987. 
8. Heidner G. L., Kornegay J. N., Page R. L., et al. Analysis of survival in a retrospective study of 86 dogs with brain tumors. J Vet Intern Med; 5:219–226, 1991. 
9. Evans S. M., Dayrell-Hart B., Powlis W., et al. Radiation therapy of canine brain masses. J Vet Intern Med; 7:216–219, 1993. 
10. LeCouteur R. A. Current concepts in the diagnosis and treatment of brain tumours in dogs and cats. J Small Anim Pract; 40:411–416, 1999. 
11. Hu H., Barker A., Harcourt-Brown T., et al. Systematic review of brain tumor treatment in dogs. J Vet Intern Med; 29:1456–1463, 2015. 
12. Campos M., Ducatelle R., Rutteman G., et al. Clinical, pathologic, and immunohistochemical prognostic factors in dogs with thyroid carcinoma. J Vet Intern Med; 28:1805–1813, 2014. 
13. Chang C. C., Tsai M. H., Liao J. W., et al. Evaluation of hormone receptor expression for use in predicting survival of female dogs with malignant mammary gland tumors. J Am Vet Med Assoc; 235:391–396, 2009. 
14. Mallinckrodt M. J., Gottfried S. D. Mass-to-splenic volume ratio and splenic weight as a percentage of body weight in dogs with malignant and benign splenic masses: 65 cases (2007– 2008). J Am Vet Med Assoc; 239:1325–1327, 2011.